실험실에서는 물 속의 어떤 구성물질도 오염물이라 생각하면 됩니다.
이런 다양한 오염 물질은, 한가지 방법에 의해 제거될 수 없으며, 그 특성에 따라 최적으로 정제하는 방법이 있습니다.
실험에 방해되는 물속의 오염물질
최적의 정제 방법
유기물
Carbon/UV램프
입자
UF필터/0.22㎛필터
파이로젠
UF필터
arium 순수/초순수 제조 장치에는 다음과 같은 정제 모듈이 내장되어 있고,각 모듈별 정제하는 역할이 다음과 같습니다.
시스템
정제 순서
정제 모듈
정제 내용
2단계
RO 멤브레인
무기이온 최대 99%, 입자 99% 이상, 미생물99% 이상, 용존 유기물(> 300 MW) 99%이상의 오염물 제거.
4단계
UV 모듈
254 nm의 파장은 살균 역할, 185nm의 자외선은 유기 물질을 산화.
6단계
Ultrafilter
박테리아, 파이로젠, 입자 등을 제거하여 분자생물 실험에 적용.
- American Society for Testing and Materials (ASTM)
Type I*
Type II **
Type III***
Type IV
Electrical ResistivityMin. (MW-cm @ 25℃)
18.0
1.0
4.0
0.2
TOC max. (m g/L)
100
50
200
No limit
Silica max. (mg/L)
3
500
*Requires the use of 0.2um membrane filter ** Prepared by distillation*** Requires the use of a 0.45um membrane filter
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (1988)
Type I
Type II
Type III
pH
N/A
5.0 - 8.0
SiO2 mg/L
< 0.05
< 0.1
< 1
Total Oxidizable Organic Carbon mg/L
< 0.2
최상의 회수율을 얻기 위해서, 농축하려는 물질의 분자량에 비해 1/2 ~ 1/3 크기의 멤브레인 MWCO를 선택합니다.
(예) 농축하려는 Target 단백질 분자량이“90,000 MW”인 경우
☞ Vivaspin 30,000 MWCO 선택
MWCO, 유공성(porosity), 시료농도, 점도, 원심분리속도, 온도 등이 있습니다.
(예) 버퍼 안에 단백질이 5% 이상이면, 농축 속도가 현저히 떨어짐
(예) 4 ℃에서 실험하는 경우, 25℃에서 실험하는 것보다 1.5배 느려짐
(예) 50% 글리세린과 같은 점도가 높은 시료로 실험하게 되면, 일반 버퍼 내의 시료를 이용한 실험보다 최대 5배 이상의 시간이 소요됨
농축 멤브레인에는 보습제인 극미량의 글리세린과 Sodium azide(아지드화나트륨)이 함유되어 있습니다. 따라서 실험 전, 전처리를 추천합니다.
[방법]
1. 단백질 용액에 사용되는 동일한 버퍼 또는 초순수를 채워 놓는다.
2. 실험 전, 여과 튜브에 흘러 나온 액은 버리고,필터를 원심기로 돌려준 후, 농축 실험 시작!
(주의! 멤브레인을 마른 상태로 두지 말 것!)
MWCO는 Molecular Weight Cut Off의 약어입니다.
이 수치로 멤브레인의 pore size를 판단할 수 있습니다. 주어진 크기의 MWCO를 가진 멤브레인은 동일한 크기(혹은 더 큰 크기)의 분자량을 가진 물질을 90% 정도 잡아줍니다.
하지만 단백질 농축 실험에서 포집율은 분자량 뿐만 아니라 다른 많은 요인이 영향을 끼치므로, 멤브레인 선택시 농축하고자 하는 단백질 분자량보다 1/2~1/3 정도의 MWCO를 가진 멤브레인을 선택하실 것을 추천합니다.
(예를 들어, 67KD의 BSA 농축 실험시, 30,000 MWCO 멤브레인을 선택)
대부분의 농축 실험에서는 가장 빠른 농축 시간 제공과 광범위한 pH 특성을 가진 PES 멤브레인을 선택하시면 됩니다.
만일 농축보다는 여과액 회수가 중요한 실험인 경우에는CTA 멤브레인을 선택합니다. 이 제품은 backing material없이 제조되어, 여과시 걸러지거나 binding되는 문제를 최소화 시켜줍니다.
또한, 매우 희석된 시료 또는 hydrophobic하고 binding되기 쉬운 시료(예를들어, IgG)인 경우에는,
대부분의 농축필터는 일회용 목적으로 제조되었습니다.
하지만, 반복적인 refilling이나 diafiltration등의 buffer exchange 등으로의 re-spinning은 가능합니다.
Vivacell 70, Vivacell 250, Vivaflow 50, Vivaflow 200은 재사용이 가능하며, 매뉴얼 내의 세척 및 보관 방법을 참조하시기 바랍니다.
두 단백질의 분자량이 10배 차이가 나면 분리 실험이 가능합니다.
만일 차이가 적더라도 어느 정도는 분리할 수 있습니다.
분리 실험시 유용한 팁은 다음과 같습니다.
1. 두개의 물질 중, 큰 물질의 분자량 대비20~25% 정도 크기의 멤브레인을 선택합니다.
2. Dilute solution에서 분리 결과가 더 좋습니다.
3. Trans Membrane Pressure가 클 수록 결과가 좋으므로, 최대의 압력을 공급해 줍니다.
4. 분리 실험은 pH에 매우 큰 영향을 받습니다. 따라서, buffer solution의 pH를 최적화하면 분리 실험 결과를 향상시킬 수 있습니다.
